Lunes, 13 de julio de 2009
 

ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (I)

Dr. D. Miguel A. Dasi

INTRODUCCIÓN

La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares, que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de unos seres a otros, y se exprese en los nuevos individuos.

Este conocimiento ha permitido cruzar barreras naturales entre especies y colocar genes de cualquier organismo, en un organismo hospedador no relacionado mediante el empleo de técnicas de ingeniería genética. Una de las consecuencias  importantes derivadas, fue la producción de fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo las  puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos, y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.

Cronológicamente podemos citar una serie de hitos que contribuyeron decisivamente en su desarrollo: la historia de su conocimiento comienza en el año 1866 cuando Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y clasificación independiente de los genes. En 1869 el científico suizo Frederick Miescher descubrió en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleina. En los años 20, el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción específica, descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas. A partir de este descubrimiento todo sucedió muy rápidamente. En 1944 Avery, McCleod y McCarty comprueban que el DNA es el portador de la información genética. En 1953 Watson y Crick revelan la estructura del DNA como una doble hélice complementaria que recuerda la estructura de una escalera de caracol. A partir de entonces y de manera exponencial, se suceden los descubrimientos (enzimas de restricción, polimerasas, etc...) que conducirán a lo que se conoce como tecnología del DNA recombinante.

¿Qué es el DNA?

Podemos considerar el DNA o ácido desoxiribonucleico, como el }cerebro~ celular que regula el número y naturaleza de cada tipo de estructura y composición celular, transmitiendo la información hereditaria y determinando la estructura de las proteínas, que a través de enzimas determinará el resto de funciones celulares.

A finales del siglo pasado se descubrió también la existencia de una segunda clase de ácido nucleico, denominado ácido ribonucleico (RNA). El RNA se encuentra tanto en el núcleo (concretamente en el nucleolo) como en el citoplasma de las células de manera abundante.

Ambos tipos de ácido nucleico, DNA y RNA, se encuentran simultáneamente en organismos eucariotas (con células de núcleo diferenciado) y procariotas (bacterias, etc.), y sólo uno de ellos en los virus.

COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos polímeros de alto peso molecular constituidos por unidades elementales denominadas }nucleótidos~, los cuales están formados por tres componentes:

1.   Molécula de azúcar            

      ð Ribosa, en el caso del RNA

      ð Desoxirribosa, en el caso del DNA

2.   Base orgánica nitrogenada

      ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y timina (bases pirimidínicas) en el caso del DNA.

      ð Adenina, guanina (bases púricas), citosina y uracilo (bases pirimidínicas) en el caso del RNA.

3.    Grupos fosfato

 

Los nucleótidos se unen formando cadenas cuyo esqueleto está formado por la unión entre un azúcar de un nucleótido y el fosfato del siguiente, quedando las bases nitrogenadas en la parte central, unidas cada una al C1 del azúcar. Estas bases son las que rinden especificidad al ácido nucleico.

 

ESTRUCTURA DEL DNA

Estructura primaria

La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:

5'-ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3'

Esta secuencia representa un oligonucleótido con 20 bases, de las cuales 6 son adeninas (A), 3 son timinas (T), 8 son citosinas (C) y 3 guaninas (G).

El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5' à 3'  ó 3' à 5'; el 5' representa el extremo terminal del fosfato y el 3' el extremo final del átomo de carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria

Edwin Chargaff analizando las bases del DNA mediante métodos cromatográficos descubre, que éstas no se encuentran en la misma proporción y que el número de adeninas es igual al de timinas y el de citosinas, al de guaninas.

En 1953 James Watson y Francis Crick construyeron un modelo tridimensional del DNA con la configuración más favorable energéticamente combinando los datos obtenidos hasta entonces sobre él, los descubrimientos de Chargaff y la interpretación tridimensional de los espectros de difracción de Rayos X; esto último fue de gran importancia para la consecución de tal modelo, el cual consiste en una doble hélice antiparalela cuyo esqueleto fundamental está formado por las cadenas de azúcar-fosfato, quedando en la parte central las bases, enfrentadas las de una cadena con las de la otra complementaria y formando entre sí puentes de hidrógeno, factor que da estabilidad a la doble hélice. El enfrentamiento de bases es constante; la adenina siempre se enfrenta con la timina y entre sí se forman  dos puentes de hidrógeno, y la guanina con la citosina, formándose entre ambas tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5' à 3' y la otra lo hace en sentido 3' à 5'. Por eso hablamos del DNA como una doble hélice antiparalela.

 

 

Disposición de la unión entre bases formando dos puentes de hidrógeno entre adenina –timina y tres puentes de hidrógeno entre citosina - guanina.

 

 

 

Estructura de doble hélice a derechas del DNA.

 

Estructuras terciaria y cuaternaria

 

Teniendo en cuenta que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior celular. Estas estructuras, terciaria y cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado seudocromosoma.

 

ESTRUCTURA DEL RNA

 El RNA generalmente está formado por una sola cadena de nucleótidos, aunque existen algunos virus que poseen RNA de doble cadena.  

Los ácidos ribonucleicos no sólo pueden tener información propia, sino que constituyen la herramienta para la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas.

   

PROPIEDADES DEL DNA

Las hebras del DNA que forman la hélice tienen orientaciones opuestas: una va en la dirección 5´-3´y su complementaria en la 3´-5´. La ruptura de los puentes de hidrógeno por calor, álcali o diversos compuestos químicos, produce la separación física de las dos hebras del DNA en un proceso denominado desnaturalización. La desnaturalización por calor es total a los 90°C y por álcali a pHs superiores a 11,3. En ambas casos el proceso es reversible, y al desaparecer el agente desnaturalizante se produce la renaturalización de la molécula, esto es, la re-adquisición de la estructura helicoidal perdida. ´

El proceso de desnaturalización va seguido por un aumento de la absorción de luz ultravioleta (260 nm) denominado efecto hipercrómico.

Otro concepto interesante de definir es el de temperatura de fusión (Tm), que es la temperatura a la que la mitad de las moléculas de una solución de ácido nucleico, han pasado a estado desnaturalizado. Esta temperatura depende del número de pares G-C que existan en la molécula de ácido nucleico. Cuando mayor sea este mayor será la Tm.

 

 

FUNCIONES DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

 

  • DNA

Su función principal consiste en la conservación de la información de la célula u organismo que lo contiene y la transmisión de esta información al replicarse.

 

 

  • RNA

En algunos virus su función es contener y transmitir información. Pero, como hemos citado anteriormente,  su función más importante consiste en la conversión de la información contenida en el DNA en proteínas específicas. Para ello existen varios tipos de RNA: RNA mensajero (RNAm), RNA transferente (RNAt) y RNA ribosómico (RNAr).

 

 

DOTACIÓN GENÉTICA DE LOS VIRUS Los virus pueden tener DNA duplex, DNA monocatenario, RNA monocatenario o RNA duplex. En algunas ocasiones, el genoma vírico dispone de la información biológica necesaria para que la maquinaria de la célula a la que parasita trabaje para él, y en otras posee la información para realizar por sí mismo las diferentes funciones para su replicación.

 

 

 

 

DOTACIÓN GENÉTICA DE LAS BACTERIAS

 

Las bacterias, al igual que los organismos eucariotas poseen los dos tipos de ácidos nucleicos antes citados: DNA, componente de su único cromosoma, y los diferentes ácidos ribonucleicos (RNAr, RNAt, RNAm). Además, las bacterias también tienen cierta cantidad extra de DNA que suele encontrarse circularizado y repetido varias veces, denominado DNA extracromosómico o DNA plasmídico y, aunque puede no contener una información específica (plásmido críptico), normalmente codifica factores de resistencia a los antimicrobianos, como b-lactamasas, etc.

 

 

Bacteria               DNA plasmídico               DNA cromosómico

DNA plasmídico

 

Dotación genómica de una bacteria.

 

 

 

CROMATINA Y CROMOSOMAS

El DNA nunca está desnudo. En eucariotas interacciona con una gran variedad de proteínas, se espiraliza y condensa para formar la cromatina y los cromosomas.

 

Los cromosomas constituyen el orden superior de empaquetamiento del DNA y se pueden visualizar al microscopio óptico. La unidad estructural por debajo del cromosoma es la fibra de cromatina  que se puede visualizar al microscopio electrónico. Esta fibra está compuesta por 6-7 nucleosomas por vuelta. Cada nucleosoma es un disco formado por un octámero de proteínas básicas denominadas histonas, donde exteriormente se enrolla el DNA.

 

REPLICACION DEL DNA

Como dijimos anteriormente, el DNA está formado por dos hélices complementarias unidas por enlaces débiles de puentes de hidrógeno que pueden romperse y volverse a formar simplemente calentando y enfriando. A estos procesos se les llama respectivamente desnaturalización y renaturalización del DNA.

Partiendo de este concepto y de manera muy esquemática, la replicación del DNA en la naturaleza consiste en:

1.  Separación de las dos cadenas que forman la doble hélice, de lo cual se encargan enzimas y proteínas que se encuentran en la célula eucariótica.  

2.   Unión de los cebadores ('primers' o iniciadores) de RNA en una de las hebras separadas. (3'®5')  

3.  Unión de la polimerasa a los lugares donde se encuentra el 'primer'  para comenzar a copiar de manera progresiva la hebra de DNA, ya que la polimerasa necesita un cebador que le indique dónde empezar, por ser incapaz de copiar DNA monocatenario.  

El sentido de la síntesis es siempre 5' à 3'.

  4.   Constitución de las nuevas copias siempre formadas por una hebra madre y otra hija, por lo que al proceso se le denomina replicación semiconservativa del DNA.

  De esta forma, de un DNA parental, tras su replicación, se obtienen dos moléculas hijas exactamente iguales.

 

 

Horquilla replicativa del DNA con todas las enzimas implicadas en la síntesis. Es necesaria la existencia de un 'primer' para que la DNA polimerasa de E. coli inicie cadenas de novo. Este 'primer' es proporcionado por una RNA polimerasa llamada primasa, la cual en asociación con un complejo de proteínas llamado primosoma sintetiza una cadena corta de RNA. La DNA polimerasa III puede utilizar este 'primer' para continuar la síntesis de DNA. Una proteína llamada helicasa (originalmente llamada rep) es necesaria para desenlazar y abrir la hélice de DNA para permitir la replicación. Las proteínas de enlace a  ssDNA se encargan de estabilizar las regiones de simple cadena que se forman  transitoriamente durante el proceso de replicación. La DNA polimerasa puede sintetizar  DNA en la dirección 5´ ® 3´, por lo que una de las hebras debe ser sintetizada discontinuamente, esto lleva a la formación de cortas cadenas de DNA con huecos entre ellas que deben ser completados por la acción de la DNA polimerasa I y unidos por la acción de una DNA ligasa.

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR

  ¿Cómo hace una molécula de DNA para codificar una proteína?

                         transcripción                       traducción  

                      DNA                              RNA                                        PROTEINA

 

Transcripción: La información del DNA es transferida al RNAm, que es sintetizado utilizando como molde el DNA original y dirigido por la holoenzima RNA polimerasa. Este RNAm será  transportado desde el núcleo a los ribosomas que se encuentran en el citoplasma.

Traducción: La factoría celular responsable de la síntesis de proteínas es el ribosoma. La molécula especifica que va a trasladar los aminoácidos (componentes elementales de las proteínas) siguiendo las pautas dictadas por el RNAm es el RNAt. Cada RNAt tiene un anticodon especifico (formado por tres bases).

   

 

Una proteína cargada denominada aminoacil tRNA sintetasa  es la encargada de unir el aminoácido correcto correspondiente al anticodon a una posición de anclaje.  De esta manera a partir de una señal de iniciación en el RNAm (codon ATG) comienza la síntesis, y el primer aminoácido transportado por el RNAt y correspondiente a este codon es la metionina. Este primer paso se denomina iniciación de la traducción y tiene lugar en una posición concreta del ribosoma denominada aminoacil (A). Posteriormente este RNAt junto con su aminoácido correspondiente salta a una posición contigua denominada peptidil (P)y llega un nuevo RNAt con el correspondiente aminoácido para anclarse en su codon y se sitúa en la posición A que ha quedado libre. Entre ambos aminoácidos se establece una unión peptídica y el RNAt de la posición P es liberado, comenzando el proceso de nuevo. Este proceso de elongación continua hasta llegar a un codon de parada.

 

 

 

Una vez sintetizada la proteína pueden haber modificaciones postranscripcionales (cortes por enzimas proteolíticas, fosforilaciones, glicosilaciones etc...

   

LA BELLEZA DE LAS MUTACIONES

Sabemos que cada gen es una secuencia de ácido nucleico que transporta información representando un polipeptido particular. Un gen es una entidad estable, pero puede sufrir un cambio en su secuencia. A ese cambio se le llama mutación.  Sin embargo las mutaciones son importantes ya que nuestro medio sufre cambios constantes y nosotros debemos cambiar con ellos o quedaremos obsoletos y moriremos.  

Uno de los mecanismos de cambio es a nivel del DNA. Las mutaciones pueden dar lugar a nuevos genes y funciones que adapten nuestro organismo a los cambios del medio ambiente en el que vive.

 

Hay distintos tipos de mutaciones:  

Mutaciones cromosómicas:

 Translocaciones: Implican un intercambio de grandes fragmentos de DNA entre dos cromosomas diferentes.

Inversiones: Aparecen cuando una región del DNA cambia su orientación respecto al resto del cromosoma.

Delecciones: Perdida de algún fragmento del cromosoma

No disyunción de los cromosomas

Mutaciones puntuales: Consiste en un simple cambio de una base.

Mutación sin sentido: Crea un codon de parada donde antes no existía.

Mutación de sentido perdido: Cambia el código del RNAm, implicando un cambio en el aminoácido codificado y por tanto en la proteína correspondiente.

Mutación silente: No tiene efecto en la proteína codificada.

 

ASPECTOS BÁSICOS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR (II)

Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o manipulación genética.  Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.

LAS ENZIMAS

Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biologia Molecular. Entre ellas podemos destacar:

Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura.

 

Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.

 

Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario.

 

Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3´ o  5´ monocatenario, de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.

 

 

 

 

 

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA “in vitro”. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.

 

Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´ de los ácidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas) etc...

 

 

LA CLONACION

 

Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.

 

 

 

 


LA ELECTROFORESIS

 

Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos.

El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares (Aaij y Borst). La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel  y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula.

 

 

El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

 

  • DNA: en pares de bases o bp.
  • RNA : en nucleótidos o nt.
  • Proteínas: en Daltons o Da.

 

 

LA HIBRIDACION

Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.

  

¿Qué es una sonda?

 

Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación.

 

Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos:

 

  • Fragmentos de DNA
  • Fragmentos de RNA
  • Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.

 

¿Qué son las moléculas reporter?

Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).

 

 

 

 

 

¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de hibridación?

 

Concentración del ácido nucleico diana

Complementariedad sonda-ácido nucleico diana

Concentración de la sonda.

Longitud de la sonda

Actividad específica de la molécula reporter.

Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...)

Tm

Acceso al ácido nucleico diana.

Formato de hibridación

 

¿Cuales son los formatos de hibridación?

 

  • Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de formación del duplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protection assay.

 

  • Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución.

Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación. 

 

Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en Biología Molecular: los Southern blot (DNA cortado con enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y Northern Blot (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección.

 

 

 

 

 

 

 

 

Hibridación in situ

 

Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. El empleo de proteasas,  que facilitan el acceso de la sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el empleo de oligosondas.

 

Sondas de PNA (Peptide Nucleic Acid)

 

Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick.  Las bases (A,T,C,G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA

 

Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales:

 

  • Son moléculas de simple cadena
  • No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible.
  • Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles.
  • Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros DNA/RNA

 

  • Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede.
  • Enlaces más fuertes
  • Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.

 

 

SECUENCIACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

 

La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen dos métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico.

 

En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.

 

Especificidad

Base                                        Reactivo                      

 

G                                             Dimetil sulfoxido

G+A                                         Acido fórmico

T                                             Permanganato Potásico

C                                             Hidroxilamina

 

 

Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes.

 

El método enzimático es el más utilizado en la actualidad. Se prepara un DNA circular lineal (clonando en el fago M13). Se introduce un cebador que va a servir para el inicio de la síntesis del DNA que vamos a marcar y a secuenciar. El cebador es específico a una secuencia complementaria del fago M13. Una polimerasa (enzima de Klenow o secuenasa) se encarga de polimerizar. Se establecen cuatro alícuotas. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos utilizando para ello los cuatro nucleótidos, pero uno de ellos está marcado. En el segundo paso se produce la terminación de las cadenas por la adición de una pequeña cantidad de un dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideoxido es un nucleótido trifosfato que  por  carecer  de grupos  OH  tanto en el carbono 2´como el 3´de la ribosa lo que imposibilita el crecimiento de la cadena paraliza la síntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizan por electroforesis en geles de acrilamida.

 

Actualmente para el marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceina, NBD(4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno para cada base. . Una vez conjugados a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e interrupción con dideoxis.

 

 

 

Geles de secuenciación

 

 

TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS

 

Se reúnen con esta denominación una serie de técnicas que nos van a permitir un aumento considerable en la detección de secuencias específicas de los ácidos nucleicos

 

Amplificación de la diana

  • PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
  • 3SR (Self sustaining sequence replication)
  • NASBA (Nucleic acid sequence based amplification)
  • SDA (Strand displacement amplification)

Amplificación de la diana

  • Qb replicasa
  • LCR (Ligase chain reaction)

 

 

Amplificación de la señal

  • Branched probe
  • Gen point (hibridación in situ)

 

EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO

Muestra Þ Extracción de A.N. Þ Amplificación de zona interés Þ  Secuenciación

 

BIBLIOGRAFÍA

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Wu R. ed. 1980. Recombinant DNA. Methods in enzymology vol. 68. Academic, New York.

 

FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Dr. D. Antonio Martínez

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán 230 moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.

 

La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes.

 

La PCR se aplicó inicialmente como una técnica de laboratorio de investigación, pero su gran especificidad y sensibilidad ha permitido el desarrollo de técnicas específicas basadas en la PCR en muchos campos de la investigación y el análisis. Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades).

 

La PCR fue desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la PCR en una técnica tediosa y costosa. La PCR mejoró vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la enzima denominada Taq polimerasa (Saiki et al, 1988) que es un enzima termoestable, por lo que permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su descubridor la concesión del Premio Nobel  en el año 1993.

 

A lo largo de la clase se repasarán los aspectos críticos que afectan a la reacción, sus componentes, así como la optimización de un protocolo de PCR.

 

 

 


RAZONES PARA LA UTILIZACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA. ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.

Dr. D. Julio Velasco.

 

 

 

1.      INTRODUCCIÓN

 

Los laboratorios de anatomía patológica se han enriquecido de una manera notoria con los avances en la inmunología y en la biología molecular, los cuales, han puesto un auténtico arsenal de técnicas novedosas para realizar diagnósticos que, hasta hace bien poco, eran exclusivamente morfológicos.

 

El uso de las técnicas de biología molecular es un hecho en muchos de nuestros laboratorios y tiene el mismo significado que tuvo la aplicación de la microscopía electrónica o la inmunohistoquimia en un pasado aún cercano. Al igual que ocurrió con con estas técnicas los inicios son confusos y la proporción de escépticos y de profesionales contrarios a su implantación como técnicas de rutina va disminuyendo con el paso del tiempo y con los crecientes logros de las mismas.

 

Es necesario que una disciplina de la  importancia de la anatomía patológica no languidezca, que se impregne de los nuevos conocimientos y que los aplique adecuadamente, que con la mayor premura comencemos a escudriñar los formidables secretos que nos depara el ADN.

 

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

 

Genética
  • Diagnóstico prenatal
  • Tipaje de HLA
  • Reordenamientos genéticos
  • Detección de esperma aneuploide
  • Creación de mapas genéticos

 

Diagnóstico Microbiológico
  • Diagnóstico rápido de infecciones víricas
  • Detección de microorganismos en células infectadas/transformadas
  • Determinación de la relación génetica entre varios tipos de microorganismos similares
  • Correlacionar la presencia/expresión de agentes virales/infecciosos en tejidos neoplásicos.
  • Determinar la resistencia a los antibióticos de las bacterias.
  • Epidemiología de las infecciones
    • Detectar y cuantificar microorganismos difíciles de cultivar o para los que no existen reactivos serológicos.
    • Detectar regiones transformantes específicas en virus

 

 

Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico
  • Detectar reordenamientos de genes
  • Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cariotípicas
  • Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo  
  • Estudio de la estructura/expresión de oncogenes
  • Detección de amplificación genética/resistencia a drogas
  • Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética

 

 

Laboratorio clínico/endocrinología
  • Detectar la producción de hormonas ectópicas

 

 

 

2. MATERIAL Y MÉTODOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA A LA ANATOMÍA PATOLÓGICA

 

     sondas de nucleótidos 

     ADN o ARN diana

     aparatos

     nucleótidos, tampones y otros reactivos

 

 

2.1. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN UTILIZADAS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA.  

 

Hibridación in situ con filtro

Hibridación Southern blot

blot invertido

dot/spot blot

Hibridación sandwich

Hibridación in situ

Hibridación Northern

Hibridación en fase líquida

Sistema de captación de hibridos

FISH

HGC

   

 

 MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN GENÉTICA  

PCR

PCR in situ

             

1.2.           OTRAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADAS A LA ANATOMÍA PATOLÓGICA.

 Técnicas de secuenciación

 Técnicas de clonación

 

 

1.3.           LA EXPERIENCIA DEL SERVICIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA DEL HOSPITAL SAN AGUSTÍN EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR.

 

En nuestro servicio comenzamos a utilizar técnicas de biología molecular desde finales de los 80. Inicialmente trabajamos con hibridación in situ en biopsias con sondas de ADN con marcaje enzimático, actualmente solamente realizamos hibridación in situ para detectar virus Epstein-Barr por medio de sondas PNA. En 1989 incorporamos a nuestro laboratorio, con material adquirido con una beca DGCYT, las técnicas de hibridación con sondas radioactivas con las que empezamos a realizar de forma sistemática el tipaje de los diferentes virus del papiloma humano. En 1991, con ayudas del  Fondo  de  Investigación  Sanitaria,  pusimos   los  primeros  ladrillos  de  lo  que  ya se  puede  considerar  como  un laboratorio  de  PCR.  En  este  laboratorio se realizan anualmente mas de 200 pruebas de PCR, fundamentalmente detección y tipaje de virus del papiloma humano y, en menor medida, detección de la t(14;18) en procesos linfoproliferativos. Para la detección y tipaje de virus del papiloma humano tras algunas pruebas con diferentes reactivos nos inclinamos por utilizar primers que amplifican un fragmento de unos 450 pb localizado dentro del ORF del virus. Esta región presenta un patrón de restricción característico para los diferentes genotipos, con lo cual podemos hacer un excente tipaje sin recurrir a técnicas de hibridación post-amplificación con el consiguiente ahorro de tiempo y, como no, de dinero. La realización de PCR para detectar virus del papiloma humano es, hoy día, una técnica que se utiliza de forma rutinaria para el manejo de las mujeres con diagnósticos citológicos de lesiones premalignas y malignas y como instrumento de control de calidad. 

 

La técnica de PCR t(14;18) la utilizamos basicamente para diferenciar procesos benignos en los ganglios linfáticos de linfomas foliculares. En nuestro laboratorio realizamos una amplificación de los dos posibles puntos de traslocación la major breakpoint region y la minor cluster region, además de un fragmento del gen de la beta-actina. La detección del producto amplificado se realiza con la técnica ELISA.

 

Brevemente utilizamos algunas otras técnicas de biología molecular en nuestro Servicio. Realizamos una pequeña serie de  dot blot con sondas biotiniladas complementarias de ADN EBV y tambien realizamos algunos experimentos con el sistema de captación de híbridos.    

 

2.4. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 

1.      FENOGLIO C, WILLMAN CL. Molecular biology and the pathologist. Arch Pathol Lab Med 111:601-619;1987

2.      NUOVO GJ,RICHART RM. A comparison of slot blot, Southern blot and in situ hybridization analyses for HPV DNA in genital tract lesions.Obst Gynecol,74:673-678;1989 

3.      SCHNEIDER A,GRUBERT T. Diagnosis of HPV infections by recombinant DNA technology.Clin Obst Gynecol,32:127-139;1989

4.      SCHOLTE GHA, VAN DOORN LJ, QUINT WGV, LINDEMAN J. Polymerase chain reaction for the detection of Helicobacter pylori in formaldehyde-sublimate fixed, paraffin-embedded gastric biopsies.  Diagn Mol Pathol 6:238-243;1997

5.      SYRJANEN S.:Basic concepts and practical applications of recombinant DNA techniques in detection of HPV infections.APMIS,98:95-110;1990

6.      VELASCO J,PALACIO V,VAZQUEZ S,MOSQUERA C,SAMPEDRO A.Muchas risasiagnostic accuracy of the cytologic diagnosis of anal HPV infection compared with DNA hybridization studies.STD;20:1-5;1993

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


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Publicado por orlandomagno7 @ 19:54
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